報告書番号

V08012

タイトル（和文）

10種の汚損性フジツボ類幼生のリアルタイムPCRによる定量的検出

タイトル（英文）

Development of quantitative detection method for larvae of 10 barnacle species using real-time PCR

概要 （図表や脚注は「報告書全文」に掲載しております）

付着生物の大量付着時期を正確に予測することで, 効率よく塩素注入等の対策を施すことが可能になる. 付着時期は浮遊幼生の出現と深く関与することから, 海域における発生状況のモニタリングは極めて重要となるが, 正確かつ効率的な手法はない. 当所ではこれまでに, 主要な汚損生物であるアカフジツボの幼生を対象に, リアルタイムPCR法による定量的検出技術を開発した. 一方, 問題となるフジツボ種は地域や発電所の設備および運用状況により異なる. そこで, 北海道を除く各地の発電所で付着が認められる主なフジツボ種であるオオアカフジツボ, タテジマフジツボ, アメリカフジツボ, ヨーロッパフジツボ, サラサフジツボ, サンカクフジツボ, ドロフジツボ, シロスジフジツボ, イワフジツボおよびクロフジツボの幼生をリアルタイムPCR法により特異的かつ定量的に検出する技術を開発した. 各種フジツボ類の12S rRNA遺伝子領域の塩基配列を解析し, 上記のフジツボ類に対応したリアルタイムPCR用プライマーセットをそれぞれ設計した. これらを用いたリアルタイムPCRによる定量的解析を行ったところ, 推定される鋳型DNA濃度と反応系に添加した鋳型DNA濃度は高い相関性を示し, その相関係数は0.98以上であった. また, 他種フジツボ類および他種動物プランクトン由来のDNAが混在する場合においても, 目的とする鋳型DNAを精度よく定量することが可能であった. さらに, 実海域において採集したプランクトンサンプルを対象に, フジツボ類幼生数の定量を試みた. 得られた幼生数は実海域での幼生の出現状況を反映しており, 本報告で開発した手法はモニタリングに使用可能であると判断された.

概要 （英文）

Real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) is recognized as one of the effective tools for the detection of marine planktonic organisms. We have been developing techniques to measure population of larval barnacle, one of the nuisance organisms at electric power stations in Japan, which settles on the wall of water intake pipes and produces troubles by growing. Our previous works showed that barnacle larvae can be identified specifically by DNA analysis of 12S rRNA gene, and quantitative detection method for larvae of Megabalanus rosa using real-time PCR was developed. In the present study, we analyzed partial nucleotide sequences of 12S rRNA gene for several barnacle species. Then, species-specific sequences were selected for 10 barnacle species and pairs of specific primers were designed for amplification. Each primer was used to amplify 12S rRNA region of several barnacle species and PCR products of each of 10 specific primer sets corresponding to barnacle species indicated single bands by agarose gel-electrophoresis. On the other hand, DNA fragments were not amplified with the barnacle species that were not corresponding to primer. Furthermore, amplifications were highly species-specific even for mixed plankton species samples collected from Shizugawa bay, Miyagi, Japan. Threshold cycles of real-time PCR using a pair of specific primers and barnacle larvae as the template were well correlated with the number of larvae. Therefore, the real-time PCR method is considered to be applicable to quantify barnacle larva for natural planktonic samples.

報告者

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