報告書番号

V08010

タイトル（和文）

遺伝情報を用いた汚損性フジツボ幼生の定量的検出方法の開発-サイクリングプローブによる簡易検出法の検討-

タイトル（英文）

Species-specific and quantitative detection method of fouling barnacle larvae based on genetic information -Examination of easy detection using cycling probe-

概要 （図表や脚注は「報告書全文」に掲載しております）

フジツボ類は主要な付着汚損性物の一つであり、これらの付着時期を的確に把握することで、より適切な対策を重点的に行えると考えられる。そのため、付着時期を把握する技術の開発が望まれており、当所では、これまでに制限酵素SpeIを用いた制限酵素断片長多型解析(PCR-RFLP)により、アカフジツボ幼生を簡便に検出可能であることを示した。また、アカフジツボ特異的なプライマーを設計し、アカフジツボ幼生を他種動物プランクトン混在下でもリアルタイムPCRにより直接定量的に検出可能であることを明らかにした。
本研究では、リアルタイムPCRを用いない簡易定量法の開発を検討した。アカフジツボ特異的なプライマーで増幅されるDNAの一部を認識するサイクリングプローブを作成した。ROXで蛍光標識されたプローブは、増幅されたアカフジツボの遺伝子断片と相補的に結合した際にRNaseHによりRNA部分が切断されて蛍光を発する。設計したサイクリングプローブを用いたリアルタイムPCRの結果、ROX-Ct値はアカフジツボ幼生数とよい相関を示した。さらに通常PCR産物を直接観察し蛍光強度を測定するリアルタイムPCRを用いない簡易定量PCR法でも幼生数の大まかな定量が可能であった。そこで、アカフジツボ出現時期に宮城県志津川湾で採集したプランクトンサンプルを用いて、検証を行った結果、簡易定量PCR法はリアルタイムPCRと同じく目視選別後のPCR-RFLP法による実測データとよい相関を示した。このことより、サイクリングプローブを用いることで、アカフジツボ幼生の簡易定量が可能であると明らかになった。

概要 （英文）

Barnacles are major fouling organisms at several electric power stations in Japan. It is useful to forecast larval settlement period of the fouling barnacle species for effective antifouling measures. In order to forecast it, precise larval detection method must be developed. We previously reported that species of barnacle larvae can be identified by DNA analysis of 12S rRNA gene, and developed easy detection method for the major fouling species, Megabalanus rosa, by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) using the restriction enzyme Spe I. Moreover, we established a quantitative identification method for Megabalanus rosa larvae by real-time PCR. However, expensive real-time PCR machine is necessary for the quantitative method.
In the present study, we tried to develop easy and quick method for the quantitative and qualitative determinations of marine barnacle larvae without using the real-time PCR machine. Recently developed cycleave PCR was applied to the method. The major results obtained were as follows.
1. The ROX-labeled DNA-RNA chimera probe (RTMr12S-Probe) was designed. The probe bound specifically to the PCR products, and was confirmed to be useful for cycleave real-time PCR, when using the Megabalanus rosa-specific primers and RNase H.
2. The cycling probe reacted with the DNA samples of Magabalanus rosa nauplii quantitatively even in samples including several kinds of planktonic organisms. The nauplii were quantified with fluorescent intensity by 28 cycle reaction (general) PCR method with the probe. Easier detection could be achieved by visual observation of PCR tube under UV irradiation, (in terms of red color intensity), after 28 cycle reaction.
3. The number of Magabalanus rosa nauplii was detected successfully even for samples including several plankton species by 28 cycle reaction PCR method with the probe. The newly developed method is considered to use practically to detect Magabalanus rosa nauplii quantitatively in the sea.

報告者

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