報告書番号

V06020

タイトル（和文）

リアルタイムPCRによる汚損性フジツボ幼生の定量的検出

タイトル（英文）

Species-specific detection and quantification of fouling barnacle larvae by real-time PCR

概要 （図表や脚注は「報告書全文」に掲載しております）

フジツボは発電所等の冷却水路系に付着して、取水流量の低下などの問題を引き起こす汚損生物である。汚損性フジツボの付着時期を予測できれば、効率よく対策を講じることが可能である。幼生の出現時期を調べることで付着時期を推定できることから、汚損性フジツボ幼生を事前に検出する技術が求められている。これまでに、問題となるフジツボ（アカフジツボ）幼生1個体の種判別に有効な遺伝子解析技術を開発し、日本沿岸に生息する主なフジツボ幼生の種判定を可能にした。本研究では、この手法をさらに発展させ、リアルタイムPCRにより混合プランクトンサンプルから直接定量的に汚損性フジツボ幼生を検出する技術を開発した。まずこれまでに得られた12S rRNA遺伝子領域の塩基配列データから、代表的汚損種であるアカフジツボに特異的な部位を選択し、特異的プライマーを設計した。その結果、アカフジツボDNAを鋳型にした時にのみPCRで増幅する84 bpのDNA断片が確認された。このプライマーを用いてリアルタイムPCRを実施したところ、DNA抽出サンプル中のアカフジツボ幼生数の対数とCt値（閾値サイクル数）に高い相関が見られ、精度の高い定量が可能であることが明らかになった。さらに、近縁種オオアカフジツボを含む他種フジツボ幼生、野外採集プランクトンが含まれる場合にも、それらに影響されずアカフジツボ幼生のみを定量することが可能であった。また、アカフジツボ幼生の発生段階による定量性の違いは約5倍あったが、この値は実海域での幼生出現ピーク時の個体数増加に比べれば小さい値であり、リアルタイムPCRによる定量法は付着時期の予測に利用できると考えられた。

概要 （英文）

Barnacles are major fouling organisms at several electric power stations in Japan. It is useful to forecast larval settlement period of the fouling barnacle species for effective antifouling measures. In order to forecast it, precise larval detection method must be developed. We previously reported that species of barnacle larvae can be identified by DNA analysis of 12S rRNA gene. Moreover, we developed easy detection method for the major fouling species, Megabalanus rosa, by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) using the restriction enzyme Spe I. However, the method includes the step of isolation of individual larvae in mixed plankton samples, which is a time-consuming process.
In the present study, we aimed for establishment of a quantitative identification method for the fouling species of barnacle larvae based on the previous study. Recently, "real-time PCR" has been developed in the field of molecular biology as quantitative method for specific DNA, expression of specific gene and so on. We adopted the "real-time PCR" for the larval quantification of the fouling barnacle, M. rosa. First of all, we selected M. rosa specific sequence in 12S rRNA gene and designed a pair of specific primers, RTMr12S-F and RTMr12S-R for the real-time PCR. When templete DNA extracted from a series of numbers of M. rosa nauplius larvae were used for the real-time PCR, their threshold cycles (Ct) were well correlated with the number of larvae. The correlation was not affected by the presence of other barnacle larvae or mixed planktons collected at natural sea. The differences in quantitative results of real-time PCR between in early nauplius stge and in late cyprid stage were observed but the differences were less than 5 times. These results indicate that the species-specific detection and quantification by "real-time PCR" is useful for the fouling barnacle larvae.

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