報告書番号

U89008

タイトル（和文）

水素生産嫌気性細菌の育種－Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍのエンドグルカナーゼ遺伝子とβーグルコシダーゼ遺伝子のクローニング－

タイトル（英文）

MOLECULAR BREEDING OF HYPER -HYDROGEN-PRODUCING ANAEROBIC CELLULOLYTIC BACTERIA -CLONING OF ENDOGLUCANASE GENES ANDA BETA-GLUCOSIDASE GENE FROM CLOSTRIAIUM CELLULOLYTICUM-

概要 （図表や脚注は「報告書全文」に掲載しております）

セルロースを分解して水素を効率良く生産する細菌を遺伝子工学的手法により育種する研究の一環として，嫌気性セルロース分解菌ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍＣｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍからセルロース分解に関与する三つの遺伝子を取得した。このうち二つはエンドグルカナーゼの遺伝子であり，他の一つはβ－グルコシダーゼの遺伝子であった。これらの遺伝子によって生産される酵素は結晶モルロースを分解できなかった。エンドグルカナーゼ遺伝子を縮小化したところ，酵素活性が高くなった。これらのエンドグルカナーゼ遺伝子を大腸菌で発見させたところ，生産された酵素は大腸菌の細胞質膜を透過し，ペリプラズム空間に蓄積された。また，これらのエンドグルカナーゼ遺伝子には調節遺伝子であるプロモーターが存在し，大腸菌の中で機能していた。

概要 （英文）

THIS RESEARCH HAS BEEN CONDUCTED ON BREEDINGANAEROBIC BACTERIA WHICH HAS AN EMPHASIZED ABILITY ON HYDROGEN PRODUCTION FROM CELLULOSE BY USING GENE MANIPULATION METHODS. THE PRESENT PAPER DESCRIBES THE CLONING OF C. CELLULOLYTICUM CELLULASE GENES. THREE DISTINCT HINDIII FRAGMENTS OF C. CELLULOLYTICUM DNA HAVE BEEN CLONED IN ESCHERICHIA COLI AND SHOWN TO EXPRESS ENZYMATIC ACTIVITIES RELATED TO CELLULOSE DEGRADATION. TWO OF THE ENCODED ENDOGLUCANASE,WHICH WERE DETECTED BY THE CONGO RED PLATE ASSAY FOR HYDROLYSIS OF CARBOXYMETHYLCELLULOSE. THE RECOMBINANT PLASMID INCLUDED THESE ENDOGLUCANASE GENE WERE NAMED PA1 AND PY1. THE OTHER FRAGMENT ENCODED BETA-GLUCOSIDASE WHICH WAS DETECED BY P-NITROPHENYL-BETA-D-GLUCOPYLANOSIDE DEGRADATION. A EXOGLUCANASEGENE WAS NOT CLONED. TWO FRAGMENTS INCLUDED IN PA1 AND PY1 WERE DELETED WITH ENDONUCLEASE AND EXONUCLEASE III. THESE DELETED PLASMID CONFEREDHIGER CARBOXYMETHYLCELLULOSE DEGRADATION ACTIVITY THAN ORIGINAL PLASMIDS. IN THE CASE OF PA1,THE ENZYME ACTIVITY (U/ML CULTURE) WAS TENFOLD HIGHER. THIS ENHANCED ENZYME ACTIVITY (U/ML CULTURE) WAS FIVEFOLD HIGHERTHAN THE ACTIVITY EXPRESSED IN E. COLIHARBORD C. CELLOBIOPARUM ENDOGLUCANASE GENE. WHEN THESE ENDOGLUCANASE GENE WERE EXPRESSED IN E. COLIHB101,THE ENDOGLUCANASE WAS SECRETED TO A PERIPLASMIC SPACE. THIS PERMEABILITY MAY CONTRIBUTE TO CELLULASE SECRETION IN HYDROGEN EVOLUTION GRAM POSITIVE BACTERIA WHICH HAS THESE GENES. TRANSCRIPTION OF THESE ENDOGLUCANASE GENES AROSE FROM A NORMAL GENE PROMOTER OF C. CELLULOLYTICUM IN E. COLI. IT IS BELEIVED THAT THESE ENDOGLUCANASE GENES ARE TRANSCRIBED BY THESE PROMOTERS IN HYDROGEN EVOLUTION CLOSTRIDIUM.

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